蚕沙中提取1－脱氧野尻霉素（DNJ）

一、概述

1、项目提出背景

在对桑叶降糖作用研究的过程中，发现桑叶中存在着具有明显抑制α－葡萄糖苷酶活性的物质——1－脱氧野尻霉素（1-deoxyrijimycin，简称DNJ）。该物质是一种含氮生物碱，在植物和微生物中都有存在，特别是在桑属植物中含量较高。桑叶、桑根皮及蚕沙中的含量均在0.11%以上，是提取DNJ的理想材料。

2、项目的目的、意义

目前，DNJ的研究和应用主要集中在工业生产和医药领域。DNJ是哺乳动物α-葡萄糖苷酶活性的有效抑制剂，α-葡萄糖苷酶在人体内主要负责从淀粉和有关多糖的非还原端切下葡萄糖，人体对淀粉、糊精、蔗糖、麦芽糖等糖水化合物的利用吸收最终依赖于小肠粘膜刷缘内该酶的活性，因此，当α-葡萄糖苷酶活性被抑制后，从而减缓肠道葡萄糖的生成速度，降低了葡萄糖对小肠吸收的正常供应，延缓和降低血糖在餐后快速的升高的现象，使患者体内保持一个较为平缓的血糖曲线，降低糖尿病并发症发生，遏止了病情的进一步恶化，达到治疗和控制糖尿病的目的，能够用于糖尿病及其并发症的有效治疗。德国生产的治疗糖尿病的药物“拜糖平”的主要成分就是α-葡萄糖苷酶活性抑制剂——DNJ。其次，DNJ具有显著的抗病毒逆转录酶活性的作用，且随着DNJ剂量的增加，其抑制能力增强。作用机理主要通过对葡萄糖苷酶活性的抑制，影响糖蛋白的修饰，造成未成熟蛋白的积累，抑制了细胞融合、病毒与寄主细胞受体结合、病毒的穿透力和合胞体的形成，从而抑制了病毒的复制，达到抑制病毒活性的目的。其三，DNJ对肿瘤转移具有抑制作用，主要通过抑制葡萄糖苷酶的活性，使肿瘤细胞表面不能产生成熟的碳水化合物链，不仅影响了肿瘤细胞的转移能力，而且这些细胞表面发生改变的肿瘤细胞容易受到寄主免疫系统的识别和攻击，从而抑制了肿瘤细胞的转移。在对小鼠β-16肺黑色细胞肿瘤的实验中，发现DNJ对肿瘤细胞转移的抑制率达80.5%。最后，DNJ还可以作为工业化生产药用高纯度麦芽糖的有效载体。一般的生产工艺淀粉水解后中间产物较多，不容易分离，效率不高。以DNJ作为载体，中间产物只有麦芽糖，通过离子交换，麦芽糖的产率可以达到42%。

蚕桑业是我困传统产业，但随着经济的发展，整个行业的投入高、收入偏低的弊端日益显露出来，给农民的生产积极性造成一定的影响，所以必须开创新的用途。蚕沙是养蚕业的副产物，在农村大多数作为有机肥利用，没有发挥出更大的价值，陕西省每年养蚕45万张，共产生0.4万吨的干蚕沙，按照20%的得率估算，可以得到800公斤的DNJ。按照目前的试剂价格计算，估价在16亿美元。利用蚕沙提取DNJ是一条高附加值的开发途径。

参考文献：

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(19) 杨海霞，朱祥瑞，1-脱氧野尻霉素的研究进展（J）中国蚕业：2002，4，60-62

二、项目立项的必要性及市场需求分析

1、项目技术攻关的必要性

市场对DNJ的需求，使其具有广泛的商业前景。目前，已经完成实验室的提取工艺，有必要进行中试，对产业化关键技术进行攻关，逐步实现工厂化的生产规模。

2、项目的市场需求分析

据调查统计，全世界现有1.2亿名糖尿病患者，我国有2000万名，且以每年1.2‰的速率递增。DNJ具有明显的治疗糖尿病的作用，本项目的提出在治疗糖尿病方面具有广阔的开发前景和市场潜力。
最近报道，以DNJ为原料研制出治疗乙肝病毒的有两种新药，N-壬基—脱氧野尻霉素（N-壬基—DNJ）和N-壬基—脱氧半乳糖野尻霉素（N-壬基—DGJ）。N-壬基—DNJ是一种N-丁基—DNJ的衍生物。在葡糖苷酶抑制剂N-丁基—DNJ的作用下，病毒糖蛋白可发生错误折叠，HBV的DNA在细胞内蓄积，HBV释放减少。N-壬基—DGJ并非葡糖苷酶抑制剂，但却有更强的抗HBV疗效。在所用浓度下N-壬基—DNJ和N-壬基—DGJ能使HBV的DNA合成分别减少8/9和14/15。它的抗病毒活性次于拉米夫定，但与其它核苷类似物相当。值得注意的是它们不干扰葡糖苷酶活性，也无细胞毒性。其作用机理可能是通过干扰前基因组RNA衣壳形成，加速病毒核心颗粒降解，影响前基因组RNA逆转录而发挥作用。此外，它们能抑制病毒核心蛋白与导致核蛋白错误装配和稳定的特异细胞因子间的相互作用。作为新的抗HBV药，N-壬基—DNJ和N-壬基—DGJ作用机制独特，弥补了核苷类似物作用的不足，而且没有核苷类似物的缺点，如干扰核酸合成，线粒体毒性等。本研究可为抗乙肝病毒新药的研制提供充分的原料。

在治疗艾滋病方面，DNJ能够抑制病毒与寄主细胞受体结合、病毒的穿透力和合胞体的形成，从而抑制了病毒的复制，达到抑制病毒活性的目的。

在药用麦芽糖生产方面，DNJ还可以作为制备药用高纯度麦芽糖的有效载体。因此上，工业化提取生产DNJ具有广泛的商业前景。

三、相关领域国内外技术现状、发展趋势及现有工作基础

1、国内外技术现状、专利等知识产权情况分析

目前，DNJ的来源有三条途径：（1）从植物或者以这些植物为食的蛾中提取，这些植物包括桑叶、桑根皮、野跛草、风信子、沙参属植物以及爵床科植物。（2）从细菌的发酵液中提取，例如浅紫灰链霉菌SEN-158、MB-733以及GC-148。（3）化学合成途径有以L-山梨糖或D-葡萄糖为起始原料的化学合成法、以非山梨糖或非葡萄糖为起始原料的化学合成法、微生物转化与化学合成结合法。

2、国内外技术发展趋势

目前，国外注重从细菌的发酵液中提取和利用化学合成途径生产DNJ原料。国内积极从事从中草药中提取DNJ的研究工作。

3、现有的工作基础
 
关于1-脱氧野尻霉素DNJ已经进行5年有关方面的研究工作。在西北农林科技大学校青年科研专项的支持下，已经完成了DNJ气相法快速检测的新方法，并建立了实验室里的提取工艺。先后对桑叶、蚕粉中的DNJ抑制α-葡萄糖苷酶活力及降糖机理进行了研究，并发表相关的研究论文3篇。

（1）桑叶降糖作用的研究初报，北方蚕业，2002，23（3）

（2）桑叶对α-葡萄糖苷酶活力影响及降糖机理研究，中国蚕业.2003.24(2).-19-20

（3）QHL3对α-葡萄糖苷酶活力影响及降糖机理研究，西北农业学报.2003.12(1).-103-106

（4）桑叶中1－脱氧野尻霉素（DNJ）的气相法测定，中国科技论文
在http://www.paper.edu.cn/privatetools/released/download.jsp?file=200601-169

四、项目计划目标及主要研究内容

1、主要目标

a.建立一套完整的从蚕沙中工厂化提取DNJ的生产工艺流程。

b.确定DNJ工业化提取技术；

c.确定DNJ工业化纯化技术；

d. 提取出试剂级DNJ100-200毫克。

2、研究与开发内容

a.DNJ的工厂化提取工艺的操作要点；

b.DNJ的工厂化纯化工艺的操作要点。

3、项目的技术关键，包括技术难点、创新点

项目的技术难点：DNJ工业化纯化技术的确定，其中包括分离柱选择、分离柱容积、洗脱液类型以及PH值等。

创新点：首次建立从蚕沙中工业化提取DNJ的工艺；同时为从其它中草药中提取DNJ及其类似物奠定了工艺基础。

五、技术、经济效益、市场风险分析

1、技术经济效益分析（含经济效益、社会效益）

随生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。目前全球糖尿病患者已超过1．2亿人，我国患者人群居世界第二。据世界卫生组织预计，到2025年，全球成人糖尿病患者人数将增至3亿，而中国糖尿病患者人数将达到4000万，未来50年内糖尿病仍将是中国一个严重的公共卫生问题。

据联合国艾滋病规划署2004年7月统计，全球感染人数现在已达三千八百万人。卫生部公布中国艾滋病的疫情，到2004年上半年，中国艾滋病病毒感染总人数已增长到近100万。

据有关资料显示，全世界约有3亿乙型肝炎病毒感染者，仅中国就有1亿人，且每年新增3000万乙肝患者，而这一数字目前正呈上升趋势。
从以上三个方面的患者人数的统计数据可以看出，工业化提取DNJ具有广泛的经济效益、社会效益。

2、推广应用前景分析（含产业化可行性）

中国目前糖尿病患者人数已达到4000万，在未来50年内糖尿病仍将是中国一个严重的公共卫生问题。直接以DNJ作为糖尿病的治疗药物，按照每位患者年平均120.00元估计，国内市场在48亿元。

3、项目实施的风险分析

直接以DNJ作为糖尿病的治疗药物，可以从市场中稳定的获得效益。以DNJ作为合成治疗艾滋病和肝炎药物的原料，将会获得更多的经济效益。多元化的用途模式，将会极大的降低和规避市场风险。

六、申请单位简况

1、单位简况（生产经营及科研情况、资产及经济状况等）

西北农林科技大学现有4622名教职工中，有专任教师1335人，其中教授231人、副教授352人，博士生导师188人，硕士生导师543人。有两院院士3人，双聘院士6人，长江学者奖励计划特聘教授1人，国家杰出青年基金获得者5人，国家百千万人才工程入选者9人，教育部跨世纪优秀人才1人，新世纪优秀人才支持计划入选者4人，高校青年教师奖获得者3人，高校青年教师资助计划入选者13人。有植物病理学、土壤学、农业水土工程、临床兽医学等国家级重点学科4个，部省级重点学科24个；有1个国家重点实验室，15个部省级重点实验室，12个国家、部省级研究中心和工程技术研究中心，2个国家野外台（站）。拥有8个博士后流动站，8个一级学科博士学位授权点，50个二级学科博士学位授权点，78个硕士学位授权点，以及4个专业学位和高校教师、中职教师在职攻读硕士学位点。先后取得科研成果5000余项，获奖成果1500余项，其中国家级奖励121项，培育出我国小麦推广面积第一的“碧玛一号”、长期主导我国小麦品种换代的“小偃6号”、自育苹果品种推广面积最大的“秦冠”等重要成果，科技成果转化产生的直接经济效益累计超过2000亿元。合校以来，科技创新实现快速发展,2004年到位科技经费达12113.7万元，产生了世界首批成年体细胞克隆山羊、国内首次从人胚胎干细胞分化得到心脏跳动样细胞团等多项重大成果，12项成果获得国家级奖励。现有16家农、林、水专业学会挂靠学校，编辑出版21种学术期刊，建立了大学出版社。学校依托杨凌示范区，积极开展科技成果的示范推广和产业化工作。1999年以来，与全国50多个县市地方政府、企业建立了科技合作关系，建立科技示范基地45个、科技专家大院37个，科技成果推广创造直接经济效益190多亿元。在国内率先提出并积极探索以大学为依托的农业科技推广新模式，受到了国家的重视和支持。学校科技园暨留学人员创业园首批进入国家级大学科技园，创办各类科技企业26家，示范推广农畜良种100多个，开发新产品40多种。

2、项目主要负责人简介

项目申请人，钱永华，男，1962年4月生，云南省昆明市人，汉族。博士，研究员。1980年7月毕业于西南农业大学蚕桑系蚕桑专业；1993年1月毕业于西北农业大学，获农学硕士学位；1998年1月毕业于浙江农业大学（现浙江大学），获农学博士学位。研究方向为家蚕病理。先后主持国家科技部中乌政府间科技合作项目、国家商务部茧丝绸风险基金项目以及省级课题13项，其它项目多项；发表学术论文40多篇。在本项目中负责整个实验方案的论证以及工艺流程的制定。

3、课题组组成简况

李宏，男，1975年5月生，在读硕士，助理研究员。1997年6月毕业于西南农业大学蚕桑丝绸学院丝绸工程专业，获学士学位。2002年12月任助理研究员。从事蚕桑综合利用及家蚕转基因技术的研究。关于1-脱氧野尻霉素DNJ的研究已经进行5年有关方面的工作。曾先后主持、参加了多项国家级以及省部级重点项目。目前主持省级自然科学基金在研项目1项、西北农林科技大学校级科研专项基金在研项目1项，发表论文20余篇。在本项目中主要负责整个实验方案的设计以及实验操作。

张正新，男，1970年9月出生，1994年7月毕业于浙江农业大学蚕桑系蚕学专业，2005年7月获西北农林科技大学研究生毕业，获硕士学位， 2005年12月任副研究员。参加工作以来先后承担科研、推广项目11项，其中主持国家星火计划项目1项、陕西省重点推广项目1项，厅局级项目2项，主要参加部省科研推广项目8项。近十年来共发表学术论文27篇，其中以第一作者在核心期刊发表论文6篇，中级刊物论文21篇，先后获省部级科技成果奖励8项，获国家专利1项。在本项目中主要负责实验材料的准备及试验资料整理。

肖乃康，1963年3月，汉族，农艺师。1986年7月毕业于河北林学院经济林系蚕桑专业。1998年12月被评聘为农艺师。先后获得陕西省科技进步奖两项、省农业技术推广奖一项、国家发明专利一项。发表科技论文10余篇。在本项目中主要负责有效成分的检测。

李玉平，男，1972年3月生，1993年7月毕业于安康农校蚕桑专业。从事蚕桑应用技术的研究与示范推广和家蚕育种工作已有11年。2003年12月被聘为农艺师。先后参加省级课题5项，其它项目2项。其中获得省级科研成果奖3项。共发表交流论文18篇。在本项目中主要负责实验材料的准备。

七、必要的支撑条件、组织措施及实施步骤

1、必要支撑条件

a.基础条件：我校所拥有的实验设备能够满足实验室制备以及检测的要求。但是对于进行工厂化提取的实验，需要购置大型的提取设备以满足项目实施的要求。

b.人员条件：研究小组的成员都参与了西北农林科技大学校级科研专项基金的实施，都能够完成项目在各个方面和各个环节上的具体工作。

c.技术条件：在西北农林科技大学校级科研专项基金（编号:04ZM012）蚕沙中1-脱氧野尻霉素（DNJ）的分离、纯化及检测主持下，建立了快速的检测方法，并且初步完成了实验室中DNJ的提取工艺。

2、组织管理的措施

项目设备的购置、实施以及进度在西北农林科技大学校科研处的管理和监督下，按照项目设计的要求，有计划的进行，从组织管理上保证项目的顺利进行。

3、组织实施的步骤

a.提取设备的购置、安装以及生产车间的改建。

b.按照实验室的工艺进行相应的参数放大以及调整，确立工厂化生产的新工艺。

c.总结实验数据，完善操作要点。

八、计划实施进展、经费预算及来源渠道

1、年度计划

a.2007.01－2007.06  设备的购置、安装以及生产车间的改建；实验试剂的购置。

b.2007.07－2008.06  确立工厂化生产的工艺流程以及技术操作要点。

c.2009.07－2009.12  整理资料，上报验收。

2、经费预算 

实验经费预算40.00万元。其中仪器设备费16.00万元，用于购置一套中型不锈钢中草药提取、浓缩设备以及大型的不锈钢制备柱；实验材料费8.00万元，用于购置标准试剂DNJ、离子交换树脂以及其它化学纯级试剂；实验室改建费6.00万元用于将现有的实验室，改建成一间约50㎡的生产车间；分析检测费4.00万元用于生产工艺过程中的检测和物质分析；业务研究费3.00万元，用于资料的检索，复印及差旅费等的支出；所雇佣临时工的劳务费按每人每年0.50万元计，共1.00万元；管理费按5%计算为2.00万元。总计40.00万元。

3、经费来源

拟申请经费30.00万元，自筹经费10.00万元。

九、其它说明
（附：项目经费支出预算表）