多功能生物医学应用的仿生天然丝纳米纤维微球

摘要 

蚕丝纳米原纤维(Silk nanofibrils,SNFs)是从蚕丝中提取的一种高潜力的蛋白质纳米纤维材料，其生物医学应用尚未开发。在这项研究中，开发了一种具有细胞外基质(ECM)模拟结构和高比表面积的SNF组装微球。通过全水处理从蚕丝中剥离SNFs，并将其用作构建微球的基石。受ECM的结构和生物活性成分的启发，透明质酸(HA)被用作生物胶来调节SNF的组装。在透明质酸的辅助下，采用电喷法制备了具有稳定蓬松结构的SNF微球。该微球具有良好的生物相容性和诱导间充质干细胞成骨分化的能力。作为多功能性的证明，SNF微球与其他分子和纳米材料进一步功能化。利用SNF微球优异的血液相容性和从分子水平到纳米尺度的可修饰性的优势，我们展示了它们在蛋白酶检测和血液净化方面的广泛应用。基于这些结果，我们预见这种天然丝基纳米纤维微球可以作为一种优越的生物医学材料用于组织工程、早期疾病诊断和治疗设备。

一、SNF微球制备

下图展示了SNF微球的制备过程和形貌。SNF是通过化学预处理和机械分解从天然丝中分离出来的。所得SNF的直径分布在50-850nm之间，平均直径约为~300nm。纳米纤维的长度达到100μm以上，具有较高的长径比。

将提取的SNFS作为基块，通过电喷涂法制备纳米纤维微球。将SNF分散体与透明质酸(HA)水溶液混合，在静电场下喷洒到液氮中，然后冷冻干燥形成多孔微球。虽然SNF是分层微球的理想候选骨架，但由于溶液粘度不足，SNF悬浮液很难单独喷射成均匀的球形颗粒。HA是一种带负电荷的线性糖胺聚糖，在ECM中起着关键作用。我们利用生物活性HA促进SNF微球的形成。透明质酸可以提高粘度，形成均匀分化的微球液滴。含有10% HA的冻干SNF微球具有规则的球形形态和蓬松的纳米纤维ECM样结构。制备的微球直径在500~1350 μm之间，平均直径约为900 μm。

添加10% HA的SNF微球在水中表现出良好的稳定性，说明HA的加入赋予了纳米纤维微球在水中的结构稳定性。在微球制备过程中，HA大分子与SNFS之间形成交联网络。EDC交联HA作为生物胶结合SNF，提高了微球在溶剂中的稳定性。交联剂和HA的引入对丝纳米纤维的结构没有明显的影响。 

图1 SNF微球的制备工艺及结构

二、SNF微球表征

HA添加量低于5%时，由于粘度不足，只形成了坍塌的微粒。加入5%以上的HA后，SNF悬浮液可以被电喷涂成微球，当HA达到20%时，大部分微球仍能保持球形形态。然而，由于过量HA的存在，微球表面变得更致密。当HA含量过多时，纳米纤维之间的“点状附着”会转变为“膜状附着”，导致微球表面形成层状结构。

微球在水中表现出很高的稳定性，即使在PBS中浸泡30天后也是如此。微球的膨胀率和保水率随着HA含量的增加而增加，这归因于HA的超亲水性。透明质酸的引入大大提高了SNF微球的亲水性和水结合能力，有利于微球作为细胞载体和支架。相反，随着HA含量的增加，孔隙率和比表面积显著降低，因为HA占据了纳米纤维之间的空间。综上所述，含10% HA的微球为作为后续实验的优化组。SNF/HA10%微球的比面积比SF/HA10%微球增加了5倍以上，表明SNF/HA10%微球在用作细胞载体或组织工程支架时具有潜在的高吸附性和负载能力。

图2 SNF微球的表征

三、SNF微球的细胞培养与分化

研究了骨髓间充质干细胞(BMSCs)在SNF微球上的增殖情况，并将其与含10% HA的再生SF海绵进行了比较。微球和多孔海绵均支持干细胞的长期生长和持续增殖。有趣的是，SNF微球上的细胞活力值高于多孔海绵，表明SNF微球具有更好的细胞相容性。进一步，在微球上评估骨髓间充质干细胞的成骨分化行为。SNF微球和多孔海绵均能支持成骨分化诱导下的细胞生长骨特异性标记物的表达，成骨标志物ALP、Runx2.Col和OCN这些基因在第7天SNF微球上的表达水平高于多孔海绵，表明SNF微球对成骨分化的诱导作用增强。 

图3 SNF微球的细胞培养与分化

四、SNF微球在分子诊断和血液净化上的应用研究

用于胰蛋白酶活性监测的特异性肽首次移植到SNF微球上用于血液分子诊断。通过控制多肽的初始浓度来调节多肽接枝率。随着多肽浓度逐渐增加到0.8mg/mL，荧光强度和硫含量增加，表明修饰成功，多肽接枝率增加。

在0-15 nM浓度范围内，荧光强度与蛋白酶浓度之间存在明显的线性关系。当浓度达到60nM时，荧光强度达到平台。微球的检出限(LOD)为11.4pM，具有良好的灵敏度。SNF微球的三维纳米纤维结构和极高的比表面积极大地改善了被检测分子与接枝肽的相互作用，从而对胰蛋白酶检测具有很高的灵敏度。

下图展示了碳纳米管功能化SNF微球的制备过程。将SNF/HA溶液与羧化CNTS充分混合后，可通过电喷涂形成均匀的复合微球。CNTS紧密附着在红细胞表面，表明CNTS对红细胞具有很大的风险。结果表明，CNTS具有明显的溶血作用，溶血度为8%，而SNF和SNF基微球的溶血度<4%，低于5%的安全值。 

图4 用于分子诊断和血液净化的SNF微球功能化研究

结论

综上所述，我们报道了一种由天然丝纳米纤维组成的仿生微球，并展示了其在生物医学上的广泛应用。在生物活性多糖HA的帮助下，SNFs可以被电喷涂成具有三维蓬松非纤维结构的微球。基于生物源性化学成分和仿生纳米纤维结构，SNF微球具有良好的生物相容性和促进骨髓间充质干细胞成骨分化的能力，具有作为细胞载体和组织工程微支架的巨大潜力。为了证明SNF微球的多功能性，制备了多肽修饰的SNF微球和碳纳米管功能化的SNF微球，并评估了它们在蛋白酶检测和血液净化方面的优异性能。SNF微球制备简便，具有良好的生物相容性和广泛的应用前景，有望推动天然丝纳米纤维在生物医学领域的应用。

文章信息

Yan S, Wang L, Fan H, et al. Biomimetic Natural Silk Nanofibrous Microspheres for Multifunctional Biomedical Applications. ACS Nano.2022;16(9):15115—15123.doi:10.1021/acsnano.2c06331

通讯作者简介

张莹莹，清华大学化学系教授，博士生导师，截止2022年4月，发表SCI论文143篇，其中93篇以通讯作者发表，包括Nature Nanotechonolgy， Nature Communucations, Science Advances, PNAS, Matter,JACS，Advanced materials，ACS Nano,Nano Letters,等。 获授权发明专利18项。出版专著一本，参著书籍两本。在国内外学术会议做邀请报告40余次。 研究成果曾被Nature、Nature Nanotechnology、C&EN、PHYS ORG、Scientific American、NanotechWeb、Nanowerk、人民日报、科技日报等专题报道。主要研究方向：纳米碳材料与丝蛋白材料的制备、性能与应用；柔性可穿戴器件及其在生命健康和信息领域的应用；功能纤维与智能织物的设计、制备与应用。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acsnano.2c06331

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